疾病早筛 | Olink蛋白组学助力国自然申请-紧跟热点，多组学并行！

蛋白质是生物学功能的承载者，蛋白组学也是近年来国自然申请的重大研究方向之一。Olink作为蛋白组学当前最热门的技术如何能够在您的国自然申请中增光添彩？下面就随着小编看一下Olink技术在不同研究方向上能够怎么应用吧！

本文主要在疾病早筛方向进行文章解析。

同时使用多种生物标志物来确定疾病状态，通常被称为“生物标志物组合”，是一种充分利用蛋白标志物的有效方法。在这项研究中，研究者通过使用Olink PEA技术对筛选和验证AD队列样本中的1160种血浆蛋白进行了分析，从而系统地研究了AD的血浆蛋白质组。研究者鉴定出19种与AD相关的血浆核心蛋白标志物，并据此开发了生物标志物模型，可准确对AD进行鉴定并确定AD患者的疾病严重程度。与现有的用于AD分类的血液生物标志物（如血浆ATN生物标志物，血浆p-tau181和p-tau217等）相比，该研究鉴定出的19蛋白标志物组合准确性更高，AUC可达 0.98，且其中7个蛋白与AD发展阶段相关，可用于AD疾病分期。

1. 入组队列： 

1.1发现队列：招募了2013年4月至2018年2月在香港中文大学威尔斯亲王医院专科门诊就诊的180名≥60岁的香港市民，其中分别含106例AD患者和74例HC。所有参与者均进行了病史评估，临床评估，使用蒙特利尔认知评估方法（MoCA）进行认知和功能评估及通过磁共振成像（MRI）进行神经成像评估。

1.2 验证队列：招募了从2018年2月至2020年3月到伊丽莎白女王医院就诊的97名≥60岁的香港市民，包括36位AD患者和61位HC。验证队列参与者接受了医学史评估，临床评估，MoCA认知和功能评估以及MRI进行的神经影像评估。

2. 血浆蛋白标志物检测

2.1 血浆蛋白组分析：由Olink瑞典实验室使用PEA技术在20微升血浆中检测1160种蛋白标志物的水平，测定的血浆蛋白水平以标准化的蛋白表达单位（NPX值）表示。

2.2 血浆中Aβ42/ 40比率，tau，p-tau181和NfL水平：由Quanterix Accelerator Lab分别使用Quanterix NF-light SIMOA试剂盒（103186），Neurology 3-Plex A试剂盒（101995），P-Tau 181 Advantage V2试剂盒（103714）在350微升血浆中测量获得。

2.3 通过酶联免疫吸附测定进一步验证选定的血浆蛋白。

1. AD患者差异表达血浆蛋白的鉴定 

血浆Aβ42/40比率，tau水平和NfL水平（统称为血浆ATN生物标志物）是AD患者血液中发生变化的最知名蛋白标志物。因此，研究者首先使用SIMOA数字生物标记物检测平台在发现队列中测量了ATN的水平。结果表明，血浆ATN生物标志物在中国AD患者中表现出一致的变化。

随后，研究者使用Olink技术鉴定了哪些血浆蛋白在AD中差异表达。在1160种经测定的血浆蛋白中，发现共有429种在AD患者中差异表达，其中包括61种显著上调的蛋白和368种显著下调的蛋白。随后，研究者使用ELISA和SIMOA平台对基于PEA鉴定出的CASP-3，CD8A和NfL进行了交叉验证。

2. 19种蛋白生物标志物组合可代表整个AD血浆蛋白质组

共表达网络分析或GO分析可以将许多功能相关的血浆蛋白分类为簇或途径，从而能够选择代表整个血浆蛋白质组的蛋白子集。研究者因此进行了相关网络分析，检查了429种AD相关血浆蛋白的整合模式，然后对所得相关矩阵进行了层次聚集聚类分析。结果共产生了19个与AD相关的血浆蛋白簇，每个簇都与独特的生物学过程和独特的细胞类型表达谱相关。研究者随后选择了与AD关联最紧密的蛋白标志物作为19个簇中的“中心”代表性蛋白标志物。

3. 由19种中心蛋白生物标志物建立的整合模型可准确区分AD

研究者根据19种核心蛋白的水平建立了AD分类的综合模型，应用该模型为每个个体生成AD分类评分，结果表明该模型在区分AD患者与HC的性能上优于血浆ATN生物标志物的模型，AUC高达0.9816，可以准确区分AD患者和HC。此外，将这三种血浆ATN生物标志物整合到19蛋白模型中并不能提高AD分类的准确性，这与之前的结果一致的，即19蛋白组合可捕获AD血浆中ATN依赖性和ATN非依赖性变化。

4. 在独立队列中验证19个蛋白生物标志物组合

接下来，为了验证该19个蛋白生物标志物组合是否可用于AD筛查，研究者在独立的“验证队列”中测量了19种核心蛋白的血浆浓度。其中6种蛋白质：KLK4，LIF-R，CASP-3），NELL1，CD164和LYN经过交叉验证，在验证队列AD患者中表现出与在发现队列中观察到的一致显著改变。此外，还有10种其他核心蛋白表现出与发现队列的变化一致趋势。

将基于19种核心蛋白标志物血浆水平的整合模型应用于验证队列可得到同样高度准确的AD分类结果（AUC = 0.9690），且再次比血浆ATN生物标记物的模型（AUC = 0.8871）更准确。此外，研究者再次验证，该模型生成的AD分类分数与认知能力相关。因此，这些发现证实了该整合模型能够准确反映与AD相关的内表型。

5. 19种蛋白生物标志物组可准确区分AD-tau病理学进展

研究者随后研究了使用血浆p-tau181作为AD-tau病理指标下，19蛋白标志物模型预测p-tau状态的性能。研究者根据血浆p-tau181水平将队列分为p-tau181阴性或p-tau181阳性组，根据Youden指数得出的cutoff值为2.55 pg/mL。结果显示，19种蛋白标志物模型确定的AD严重程度水平与p-tau181状态显著相关：严重组中≈80％的个体为p-tau181阳性，而正常组中为≈20％。

此外，由于p-tau181状态与认知表现，脑区域容量和血浆ATN生物标志物方面相比，能更准确地对AD进行分类。因此，研究者在发现和验证队列中均观察到了p-tau181阳性AD中19种血浆核心蛋白的变化更显著。具体而言，19蛋白标志物物模型可准确地区分p-tau181阳性AD患者和p-tau阴性HCs，在发现队列中AUC可达 0.9881，在验证队列中AUC达0.9863，在组合队列中AUC达=0.9844。

因此，这些结果共同证明该19蛋白模型对tau病理分类的AD具有特别高的准确性，为开发针对AD的高度特异性的基于血液的诊断工具提供了基础。

总之，该研究不仅为开发可用于临床环境中AD筛查和监测液体活检技术奠定了基础，还为将来的治疗方案开发提供了丰富的蛋白质靶标。

接下来会从药物评估、疾病治疗靶点、以及多组学研究等方向进行分析，请大家持续关注！