Xenium空间原位检测技术—“后单细胞时代”研究利器

之前看到过一篇关于单细胞测序技术的文章，作者用“如日中天”来描述单细胞测序技术的火热程度，事实上也确实如此。从2013年单细胞被nature methods评为年度技术至今（2023年）的10年时间里，大量基于此技术的文章被发表。在NCBI的 pubmed上搜索single cell RNA关键词，会发现有多达44809篇相关的文献被发表（图1），包含大量的疾病类型，组织类型的细胞图谱类文章。2023年10月，国际顶尖期刊 《Science》 及Science 子刊 《Science Advances 》和《Science Translational Medicine》同时发布21篇论文，这一系列研究从单细胞层面绘制了迄今为止最全面的人类和非人灵长类动物大脑细胞图谱，揭示了3000多种脑细胞类型的特征。2022年5月， Science发表了题为“Cross-tissue immune cell analysis reveals tissue-specific features in humans”的研究论文，该研究通过单细胞 RNA 测序和 VDJ 测序从来自 12 名成年供体的 16 种组织的免疫器官中获取了约 360,000 个细胞的数据集。2022年，北大张泽民院士在Science 发表了题为“Mapping cell types across human tissues”的述评文章，指出这些泛组织研究使我们更接近于建立一个全面的人类单细胞图谱。数量如此之多的单细胞数据一方面说明该技术的重要性，另一方面也给大家提醒，“后单细胞时代”也已到来。

回答这个问题之前，需要先剖析下单细胞测序技术解决了什么，遗留了哪些问题需要解决？第一，单细胞测序可以解析所研究组织中的细胞类型组成是什么（包括已知的细胞类型，已知细胞类型的亚型和潜在的新的细胞类型）和这些细胞类型的基因表达谱是什么；第二，这些细胞类型之间是否存在相互作用，是通过什么在进行互作；第三，细胞类型的组成在样本间的差异包括含量上的差异和基因表达上的差异。最终确定和疾病进程，疾病预后评估，用药评估等临床相关的细胞类型，特定细胞类型中的某个基因等信息。

由于单细胞测序的样本需要制备成细胞悬液，所有细胞会丢失其在组织中的位置信息，以及基因表达的位置信息。而细胞类型在组织中的分布信息又直接与疾病的进程、预后、药物治疗效果等信息相关。因此有必要进一步明确单细胞测序结果中的关键细胞类型的空间位置分布和特定基因表达的空间位置分布。常见的单细胞测序后验证实验为FISH（免疫荧光原位杂交），IF（免疫荧光）和IHC（免疫组化）。这些技术的缺点是只能对少数基因进行（表达量和空间位置分布）验证，且通量较低（验证的基因数较少）；无法直观的分析细胞的分布信息，不能体现组织中的细胞微环境组成情况。

Xenium是单细胞水平的空间原位分析技术，可以在单细胞水平上定位细胞的在组织切片上的空间位置分布，特定基因表达的空间位置分布，以及细胞分布，基因表达分布。其分辨率可以达到200纳米。并且可进行细胞切割以及分析边界信息，找到细胞核和细胞边界坐标(图2)。Xenium可以从以下3个方面来进行研究：

▪ Xenium可以作为一个验证平台来对单细胞测序得到的关键基因进行空间表达验证，最多可以检测500个基因，还支持自由定制感兴趣的目的基因。另外，Xenium还适用于组织芯片的样本类型的检测。

▪ Xenium可以作为单细胞的互补平台，对单细胞测序得到的细胞类型进行空间定位，分析组织中的细胞微环境，以及对关键基因进行表达的验证。最终阐明空间位置信息与临床信息的相关性。

▪ Xenium可以作为独立的平台来进行研究。

Xenium作为一个靶向基因检测技术，目前商业化的检测panel有Human Breast Gene Expression Panel（280+100），Human Brain Gene Expression Panel（266+100），Human Lung Gene Expression Panel（289+100），Human Multi-Tissue and Cancer Gene Expression Panel（377+100，包括9种组织类型，乳腺，肺，结直肠，胰腺，淋巴结，皮肤，心脏，肾脏，肝脏），Mouse Brain Gene Expression Panel（268+100），Xenium Mouse Tissue Atlassing Panel（379+100，包括19中组织类型，脂肪组织，膀胱，骨髓，眼睛，肾脏，胰腺，肺，淋巴结，膀胱，皮肤，乳腺，胸腺，肝脏，心脏，大肠，舌，肢体肌肉，脑，气管）其检测的基因数量的范围为1-480个，以及个性化定制panel（1-480个基因）。有限的基因数是否可以全面的检测出目标组织中常见的细胞类型呢？答案是可以的。研究人员为了验证人乳腺样本中的细胞异质性，将Xenium检测到的细胞类型与预期的细胞类型进行比较（细胞类型为单FFPE样本的Chromium Gene Expression Flex技术检测到的细胞类型）。当单细胞Flex数据被过滤到313个基因（与Xenium panel中的基因一致）后，其仍然可以得到与所有基因的单细胞数据一致的细胞类型，且与Xenium得到的类型也一致，该结果确认基于Xenium人类乳腺panel中的基因可以得到与单细胞一致的细胞类型(图2)。

为什么会有一致的结果？仔细分析Xenium Human Breast Gene Expression Panel中的280个基因会发现，这些基因大多数为乳腺组织中常见细胞类型的marker基因（图3），基于这些基因的聚类获得的细胞类型与单细胞聚类得到的细胞类型是一致也就不难理解了。

以下为两个Xenium的研究数据，结果显示Xenium技术可以检测到与预期相一致的细胞类型信息。

1. 样本信息：人胰腺癌（腺癌）

结果显示，所有预期的胰腺细胞类型都被清楚地识别出来，包括腺泡细胞(分泌性外分泌细胞)、内分泌细胞和导管细胞。免疫细胞的多样性也可以被区分，包括淋巴内皮细胞。至少有三种不同的肿瘤亚型被检测到，其中一种亚型的特点是缺乏CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节因子)表达，CFTR是胰腺导管分泌功能的关键基因，另一种亚型包括获得肿瘤和导管基因表达的化生腺泡细胞（图4）。

通过对Xenium实验后的切片（同一张切片）进行HE染色，以及将鉴定到的细胞类型进行空间定位发现，有胰腺癌肿瘤细胞可以与HE染色病理结果一致（图5，左上，细胞分割，左下，HE染色，右上，肿瘤细胞亚类分布，右下，ductal cell分布）。

通过KD-tree算法来解析细胞分布的空间特点，结果发现每种肿瘤细胞亚型都被独特的细胞邻居所包围，例如CFTR−肿瘤细胞主要与巨噬细胞相邻，表明该细胞亚型更可能与肿瘤的生长、进展和侵袭性相关（图6）。

2. 样本信息：人乳腺癌

结果显示，所有预期的乳腺细胞类型都被清楚地识别出来，包括基质细胞，内皮细胞，巨噬细胞，肥大细胞，T细胞，B细胞以及发现了罕见的表达所有三种激素受体的三阳性细胞，这些三阳性细胞被归类为ERBB2(HER2)阳性，ESR1(ER)阳性和PGR(PR)阴性的乳腺肿瘤。（图7）。

同一种细胞类型分布在不同的区域时，其基因表达和功能上可能也存在着较大差异，这些差异在某种程度上可以反映出该细胞类群在应对该环境（比如说肿瘤区域）所做出的反映和应答。通过Xenium explorer的手动圈（如下图）选区域功能，根据切片的病理信息，手动圈选出切片上中的病理结构区域，比如肿瘤和非肿瘤，三级淋巴结构等来比较区域间的特定细胞的基因表达差异。在本研究中，可以手动圈选肿瘤区域和非肿瘤区域，然后对两个区域中的Macrophages，B cells，Monocytes进行差异基因的筛选和功能分析。最终差异这些细胞类群和肿瘤之间的相关性（图8）。

通过Xenium explorer的手动圈（如下图）选区域功能，根据切片的病理信息，手动圈选出切片上中的病理结构区域，比如肿瘤和非肿瘤，三级淋巴结构等来比较区域间的细胞组成的差异。在本研究中，可以手动圈选肿瘤区域（区域1）和非肿瘤区域（区域2），然后对两个区域中的细胞组成进行分析（图9）。

为了研究组织中的细胞微环境，可以对组织切片上的细胞类型进行空间上共定位分析（co-location analysis）。寻找潜在的相互作用的细胞群体（图10）。